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      • 你知道無內毒素質粒小提中量試劑盒的操作方法么?

      • 點擊次數:20 發布時間:【2022-04-18】
      •   你知道無內毒素質粒小提中量試劑盒的操作方法么?不知道沒關系,下面讓我們一起來了解一下吧。
         
          1、取50µL新鮮的菌液接種到15-50mL(勿超過50mL)的LB培養基,37oC震蕩培養14-16小時。室溫下5,000xg離心10分鐘,收集菌體,并盡可能的吸去上清。
         
          2、加入2.5mLBufferA1(確保已加入RNaseA),用移液器或渦流震蕩確保**沉淀重新懸浮。
         
          3、加入2.5mLBufferB1,輕輕地反轉5-10次以混合均勻,然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。
         
          4、加入600µLBufferN3,立即反轉5次,用手用力搖晃3-5次充分混勻,此時出現白色絮狀沉淀。
         
          5、將離心管轉至高速離心機,在室溫下13,000xg離心10分鐘(若上清中有白色沉淀,可再次離心)。
         
          6、定量吸取離心后的上清液至新的15mL管中(避免吸起沉淀),加入0.1倍體積的EndoCleanBuffer,混勻后冰浴10分鐘,其間不時搖勻(若EndoCleanBuffer粘稠難吸,可將槍頭剪掉頭后再吸取)。
         
          7、室溫下(冰浴取出后務必使溶液溫度恢復到23oC以上,否則溶液不分層)13,000xg離心10分鐘(也可在2,500xg離心15分鐘)。此時溶液分為兩層,上層水相含有質粒,下層紅色有機相含有。
         
          8、將上層水相轉移至一個新的15mL管中,加入3mL的BufferN3及3mL的100%ethonal,用手用力甩5次以混勻,該混合溶液需要需馬上進行過柱吸附操作。
         
          9、立即轉移6.0mL裂解液至帶收集管的DNA柱中,室溫下>2,500xg離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。重復此步直至所有的溶液通過DNA柱。
         
          10、可選:向DNA柱中加入3.0mLBufferKB,室溫下>2,500xg離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。
         
          11、向離心柱中加入5mL70%乙醇,室溫下>2,500xg離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。重復步驟“11”。
         
          12、將離心柱放回高速離心機中,室溫下>2,500xg開蓋離心10分鐘,以徹底去除殘留的乙醇。
         
          13、將離心柱轉至一個新的15mL離心管中,向DNA柱膜的正中加入0.5mL的EndofreeElutionBuffer,室溫放置1分鐘,>2,500xg離心5分鐘,以洗脫質粒DNA。若想提高得率,可用洗脫得到的0.5mL的EndofreeElutionBuffer再洗脫一次,收集到新的離心管中。
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