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      • 液體即用試劑
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      • CCK-8 細胞增殖.毒性檢測試劑盒
      • CCK-8 細胞增殖.毒性檢測試劑盒


        Cell Counting Kit簡稱CCK-8試劑盒,為MTT法的替代方法,是一種基于WST(水溶性四唑鹽,化學名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。CCK-8 細胞增殖.毒性檢測試劑盒

        Cell Counting KitCCK-8試劑盒)


        目錄號

        產品名稱

        規格

        包裝

        CC-K01

        Cell Counting Kit

        100

        1mL

        CC-K05

        Cell Counting Kit

        500

        5x1ml

        CC-K10

        Cell Counting Kit

        1000

        10x1mL

        CC-K30

        Cell Counting Kit

        3000

        30xmL


        產品簡介:

        Cell Counting Kit簡稱CCK 試劑盒,為MTT法的替代方法,是一種基于WST(水溶性四唑鹽,化學名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。


        CCK-8法與其它檢測方法之間的比較:

        細胞計數方法

        MTT

        XTT

        WST-1

        CCK-8

        形成的formazan的水溶性

        產品性狀

        粉末

        2瓶溶液

        溶液

        1瓶溶液

        使用方法

        配成溶液后使用

        現配現用

        無需預制

        無需預制

        檢測靈敏度

        很高

        很高

        檢測時間

        較長

        較短

        較短

        zui短

        檢測波長

        560-600nm

        420-480nm

        420-480nm

        430-490nm

        細胞毒性

        高,細胞形態完全消失

        很低,細胞形態不變

        很低,細胞形態不變

        很低,細胞形態不變

        試劑穩定性

        一般

        較差

        一般

        很好

        大批量樣品檢測

        可以

        非常適合

        非常適合

        非常適合

        便捷程度

        一般

        便捷

        便捷

        非常便捷









        CCK用途:藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

         操作說明:

        一、制作標準曲線(測定細胞具體數量時)

        1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量,然后接種細胞。

        2、按比例(例如:1/2比例)依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度,一般要做3-5個細胞濃度梯度,每組3-6個復孔。

        3、接種后培養2-4小時使細胞貼壁,然后加CCK試劑培養一定時間后測定OD值,制作出一條以細胞數量為橫坐標(X軸),OD值為縱坐標(Y軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(試用此標準曲線的前提是實驗的條件要*,便于確定細胞的接種數量以及加入CCK后的培養時間。)

        二、細胞活性檢測

        1、在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)。將培養板放在培養箱中預培養(在37,5% CO2的條件下)。

        2、向每孔加入10 μLCCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數)。

        3、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

        4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

        5、如果暫時不測定OD值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

        三、細胞增值-毒性檢測

        1、在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養24小時(在37,5% CO2的條件下)。

        2、向培養板加入10μL不同濃度的待測物質。

        3、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間(例如:6、12、2448小時)。

        4、想每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數)。

        5、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

        6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

        7、如果暫時不測定OD值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

        注意:如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加CCK之前更換新鮮培養基(除去培養基,并用培養基洗滌細胞兩次,然后加入新的培養基),去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。
         備注:
        建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK試劑后的培養時間。
        有條件的情況下建議采用多通道移液器,可以減少平行孔減的差異。加入CCK試劑時,建議斜貼著培養板壁加,不要插到培養基頁面下加,容易產生氣泡,會干擾OD值讀數。
        白細胞可能需要培養較長時間。
        當使用標準96孔板時,貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 / (100 μL 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 / (100 μL 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK溶液。
        如果沒有450nm的濾光片,可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片,但是450nm濾光片的檢測靈敏度zui高。

        培養基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。

        活力計算:

        細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A0加藥)-A(空白)] ×100
        A(加藥):具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度
        A(空白):具有培養基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度
        A0加藥):具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
        *細胞活力:細胞增殖活力或細胞毒性活力

        1.一個孔中應接種多少個細胞當使用標準96孔板時,貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 / (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 / (100 μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

        2.能否用384孔板進行試驗?

        可以。向各孔中加入培養基體積10%CCK-8溶液,如果加入的CCK-8體積太少,可以先將CCK-8溶液稀釋1倍,然后加入培養基體積20%的量。

        3.能否用24孔板進行試驗?

        可以。向各孔中加入培養基體積10%CCK-8溶液。

        4.酚紅會影響檢測嗎?

        不會。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。

        5.CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性?

        有。然而,請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同,因此結果可能不同。

        6.CCK-8能否檢測細菌細胞?

        可以檢測E.coli,但不能檢測酵母細胞。向100 μl E.coli培養液中加入10 μl CCK-8溶液,隔夜或培養1-4個小時7.CCK-8穩定嗎?

        CCK-80-5下能夠保存至少6個月,在-20下避光可以保存1年。如果需要長期保存,我們推薦-20的儲藏條件。

        8.如果沒有450 nm的濾光片,還可以使用哪些其他濾光片?

        還可使用450 nm490 nm之間的濾光片。

        9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差?

        可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

        10.CCK-8是什么顏色?

        應該是粉紅色。若顏色不一樣,有可能會影響測定。

        11.CCK8能否對活細胞進行染色?

        不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8),并通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能對細胞進行染色。

        12.CCK8檢測溶液對細胞是否有毒?

        CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是,加到培養基中的CCK8是沒有毒性的,因為被稀釋了10倍。因此,長時間的培養,如隔夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測,如結晶紫檢測,中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同,因此在需要進行長時間培養時,先檢測一下細胞在加入CCK8培養后的活力。

        13.在做加藥實驗時,藥物對測定是否有影響?如何解決?

        有時會有影響。如果藥物具有還原性,會和CCK8發生顯色反應,增加吸光度。解決辦法:首先要確認藥物是否有吸收,在含有藥物的培養基中加入CCK8,測定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (CCK8)的吸光度高,則證明藥物有影響,可在加CCK8之前更換培養基,去掉藥物的影響。

        14.每次測定的數值不一樣,是什么原因?如何解決?

        可能會有以下幾個原因: 1. 當在培養箱內培養時,培養板zui外一圈的孔zui容易干燥揮發,由于體積不準確而增加誤差。 一般情況下,zui外一圈的孔只加培養基,不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產生誤差,建議在加入CCK8后,輕輕敲擊培養板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000100,000/孔范圍內摸索條件。

        15.如何設定空白對照?

        在不含細胞的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時,還應考慮藥物的吸收,可在不含細胞,加入藥物的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度作為空白對照。

        16.哪些物質會影響CCK8的測定?

        當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定,例如含有維生素CGlucose (一般培養基中的量不多,酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下,會增加空白吸收,但不影響測定,扣除空白吸收即可。

        17.在實驗中吸光度值太高,如果不能減少細胞數量,如何解決?

        可以縮短加入CCK8后的培養時間。例如:可以把加入CCK8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。

        18.設定參比波長的目的是什么?必須設定嗎?

        不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。

        19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法,如果使用24孔板貨12孔板,應該加多少量CCK-8試劑?

        一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養基體積的1/10。

        20.CCK-8顯色過程中,如何終止反應?

        有一下幾種方法(96孔板): 1、 在顯色反應后,將培養板仿佛4冰箱內。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意:反應停止后,應在24小時之內測定。

        21.必須預培養細胞嗎?

        不一定。如果要向保持細胞的狀態,建議預培養細胞。如果不做細胞預培養,細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養,但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。

        22.如果加入的藥物中含有金屬,是否會有影響?

        金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話,將會100%抑制。

        23.CCK-8試劑的保存條件?

        在避光條件下CCK-8試劑在4可保存一年。如果需要保存較長時間的話,推薦在-20下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收,從而影響檢測結果,若經常使用可將試劑存放在4冰箱內保存。

        24.預培養后,更換培養基需要細胞計數嗎?

        一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞,用血球計數盤計數,制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話,可以預培養后取培養基用血球計數盤進行計數。

        25.CCK-8對于不同的細胞,靈敏度是否一樣?

        不一樣,懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞,一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高,但對于懸浮細胞則可能吸光度較低,可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。

        26.懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別?

        懸浮細胞由于染色比較困那,一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易,若細胞數量過大,有時吸光度會超過酶標儀的讀數。

        27.應該每次做標準曲線嗎?

        建議每次做。雖然細胞是一樣的,但是細胞的狀態不一定一樣,對于狀態不一樣的細胞,建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣,靈敏度可能會有輕微的差異,對于不同的批號建議分別做標準曲線。

        28.有時在藥物作用情況下,細胞已經死亡,但是脫氫酶的活性還在,是否能計算細胞數量?

        不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量,如果細胞已經死亡,但脫氫酶的活性還在,則試劑測定的細胞數量將會比真實值高,不能真實反映活細胞數量,建議采用別的方法測定。

        29.實驗之前,是否需要先檢測一下培養基和CCK-8是否會反應?

        建議使用一個孔作一下檢測,因為有培養基中可能含有氧化還原反應的物質,在正式實驗之前有必要先確認培養基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。

        保存條件:

        4干燥避光保存,有效期一年。

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